专利名称：Peg修饰的重组人源过氧化氢酶的药物用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及PEG修饰的重组人源过氧化氢酶的药物用途，具体涉及制备治疗病毒、细菌引起的感染药物中的用途，尤其涉及PEG修饰的重组人源过氧化氢酶在制备治疗病毒、细菌及烧伤等感染引起的急性肺炎及烧伤感染药物中的用途。
背景技术：
过氧化氢酶广泛存在于各种需氧生物和一些厌氧生物中，是体内过氧化酶体的组成之一和最标志性的酶，约占过氧化物酶体酶量的40%左右。有研究发现，过氧化氢酶特异高效地将过氧化氢分解成水和氧气。在正常的生理活动中，细胞有氧呼吸所消耗的O2约10%被还原成H2O2，进而产生一系列活性氧自由基，而过氧化氢酶的正常生理功能就是清除体内生成的过氧化氢，并抑制过氧化氢向其他活性氧自由基转化。正常状态下，体内活性氧生成和清除处在一个平衡的状态，而在病理状态下，机体氧化还原状态的平衡被打破，抗氧化体系受到抑制，导致机体内过量的活性氧自由基存在，进而引起机体的氧化损伤。有研究证实，在若干病理状态下，生物体内的过氧化氢酶含量均有所下降，如糖尿病人体内的过氧化氢酶含量显著低于正常人，阿尔茨海默病病人脑内的过氧化氢酶活力也受到抑制。还有研究表明在体外肿瘤模型中，过氧化氢酶活力的减弱是肿瘤发展进程中一个非常重要的因素。目前，有关上述方面的研究已有不少报道，如采用转基因的方法使小鼠线粒体过氧化氢酶高表达可延长小鼠生命，延缓心脏病和白内障的发生和发展，减轻氧化损伤。有研究认为诱导体内过氧化氢酶的表达可作为抗氧化治疗上的一个新的途径。有很多报导指出，外源性过氧化氢酶对疾病，尤其是氧化性疾病的进程有一定的缓解作用。研究结果证 实，小鼠静脉注射外源过氧化氢酶极大地降低了过氧化氢诱导的脂质过氧化，维持血液循环的过氧化氢酶活性能抑制肺部肿瘤转移，高表达过氧化氢酶可使晶状体上皮细胞的抗氧化耐受性增强；所述的过氧化氢酶抑制了氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的人动脉平滑肌细胞增殖。上述报道均显示了过氧化氢酶在氧化损伤方面的研究方兴未艾。

发明内容
本发明的目的是提供PEG修饰的重组人源过氧化氢酶新的药物用途，涉及PEG修饰的重组人源过氧化氢酶在制备治疗病毒、细菌及烧伤等感染引起的急性肺炎及烧伤感染的药物中的用途。具体而言，本发明的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶的药物用途，其特征是将基因工程表达的人源过氧化氢酶用PEG修饰后，用于治疗由氧自由基(ROS)引起的氧化损伤性疾病；所述氧化损伤性疾病具体包括病毒、细菌及烧伤等感染引起的急性肺炎及烧伤感染。本发明通过动物实验，结果显示，所述的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶对病毒包括流感病毒、SARS病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒，细菌包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷博氏菌有明显的抑制作用。本发明中，所述的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶，为经PEG修饰、DNA序列为人源过氧化氢酶cDNA在毕赤酵母中表达并经纯化的产物；
所述的重组人源过氧化氢酶具有序列I的序列。本发明的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶通过下述方法制备
将人源过氧化氢酶和活化的PEG 5000以一定的摩尔比投入到硼酸缓冲液，4°C混合均匀后搅拌反应12h，每2h取样一次，检测混合物中的过氧化氢酶活力；反应完成后通过Sephacryl S-300树脂柱，用20mmol/L的pH 7.0的PBS洗脱，分别收集修饰和未修饰得组份，进行SDS-PAGE电泳分析；所述PEG修饰的人源过氧化氢酶透析后分装入灭菌的安培瓶，冷冻干燥，用O. 05M的PBS缓冲液溶解，O. 22um滤膜过滤。本发明的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶进行了抗氧化作用动物实验
采用ICR小鼠(由上海伊莱克斯实验动物有限公司提供)，流感病毒感染引起机体一系列氧化损伤，通过鼻腔给与PEG修饰的重组人源过氧化氢酶，进行抗氧化试验，检测体重变化、死亡保护、局部病理切片，并进行抗氧化能力评价，数据均采用SPSS15. O软件进行统计分析。实验结果证实，所述的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶，可有效对抗流感病毒H1NUFM1导致的急性肺炎，使肺部病毒滴度减少、抗氧化能力和动物免疫保护增强、减缓急性肺炎的病理进程，从而使肺组织损伤减轻和小鼠体重下降，最终降低小鼠的死亡率，延长存活时间。本发明的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶可与药学尚可接受的载体，制成药物制齐 ，所述的药物制剂制成鼻腔吸入剂、腹腔注射剂及外用制剂，通过鼻腔吸入给药、腹腔给药或外用药等给药方式，用于治疗由氧自由基(ROS)引起的氧化损伤性疾病，具体涉及治疗病毒、细菌及烧伤等感染引起的急性肺炎及烧伤感染。为了便于理解，以下将通过具体的实施方式对本发明的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶的药物用途进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。


图I显示了毕赤酵母表达的人源过氧化氢酶分离纯化情况，其中，A为SDS-PAGE鉴定图，I为发酵液上清硫酸铵浓缩液，2为发酵液经硫酸铵浓缩后、疏水柱脱盐后、上柱于Q-S柱、纯度已经达80%，3为将Q-S柱分液、再经羟基磷灰石、纯度达95% ;B为westen-blot鉴定图，I为发酵液上清浓缩液，2为Q-S离子交换柱纯化后的人源过氧化氢酶，3为羟基磷灰石柱分后的人源过氧化氢酶。图2显示了人源过氧化氢酶的PEG修饰产物的分离纯化情况，其中，I为未修饰的人源过氧化氢酶，2为修饰后混合物，3为上样样品，4为分离出的未经修饰的人源过氧化氢酶，5为PEG修饰的人源过氧化氢酶,6为蛋白分子量标准，自上而下依次为94kD、66kD、43kD。图3显示了感染病毒浓度对死亡率的影响。
图4是感染后感染病毒后体重变化曲线图。图5显示了肺组织病理学分析(X 100)，其中，A为N组的肺组织切片，可观察到完整正常的肺组织结构；B为V组的肺组织切片，重度间质性肺炎，可观察到严重的组织血管水肿，炎症细胞浸润和肺萎陷；(为R组的肺组织切片，无肺萎陷，但是血管周围有炎症细胞浸润；D为C组的肺组织切片，轻度肺萎陷，血管周围有炎症细胞浸润；E为H组的肺组织切片，肺萎陷有所改善，组织结构大体完整；F为M组的肺组织切片，肺萎陷有所改善，但是血管周围有严重的炎症；G为L组的肺组织切片，严重细胞浸润和肺萎陷肺病变基本无改善。图6是病毒血凝滴度测定图，其中，与V组相比，p〈0. 05，**: p〈0. 01。图7显示了抗氧化能力，其中，A为各组肺组织过氧化氢酶活力，与V组相比，p〈0. 05 ;B为各组清除超氧阴离子和超氧自由基能力，与V组相比，p<0.05, p<0.01 ；C为各组MDA含量，与V组相比，p<0. 05,林:ρ〈0·01。
图8是网状内皮系统吞噬能力比较图，与V组相比，ρ〈0·05，**: ρ〈0·01。图9显示了对免疫系统的保护，其中，A为各组肺指数比较，与V组相比，ρ〈0·05，**: ρ〈0.01 ;Β 为各组胸腺指数比较，与 V 组相比，ρ〈0·05，**: ρ〈0·01。
具体实施例方式实施例I PEG修饰的重组人源过氧化氢酶对流感病毒所致急性肺炎的作用 I、PEG修饰的重组人源过氧化氢酶的制备
采用毕赤酵母表达的人源过氧化氢酶，将发酵液4°C离心，收集上清，用硫酸铵沉淀粗酶液，然后依次上苯基纤维素疏水柱、Q-Sepharose FF和羟基磷灰石，获得95%纯度的目的蛋白，将纯化的人源过氧化氢酶和活化的PEG 5000以一定的摩尔比投入到硼酸缓冲液，4°C混合均匀后搅拌反应2h，将修饰反应混合物取适当的蛋白量上样于预先装好的Sephacryl S-300树脂,用20mmol/L的pH 7.0的PBS洗脱,流速lml/min ;核酸蛋白检测仪于280nm处监测洗脱液蛋白含量，并用自动收集仪收集各流分，进行SDS-PAGE电泳分析；收集的PEG修饰的人源过氧化氢酶透析后分装入灭菌的安培瓶，冷冻干燥，-20°C保存备用。2、PEG修饰的重组人源过氧化氢酶鼻腔滴剂的制备
将冷冻干燥的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶用O. 05M的PBS缓冲液溶解，O. 22um滤膜过滤，备用。3、动物实验
实验动物采用ICR小鼠，体重16-18g;病毒株采用流感病毒Al (HlNl)鼠肺适应株FMl。流感病毒感染小鼠将小鼠雌雄各随机分组，设正常对照组(N组)、病毒对照组(V组)、未修饰人源过氧化氢酶组(C组)、利巴韦林组(R组)、PEG修饰的人源过氧化氢酶高中低(H、M、L)三组。病毒组和给药组小鼠用乙醚麻醉后鼻腔感染STCID5tl病毒；感染后2h开始第一次给药，一天给药两次，共给药4天；第五天杀剖，采血和取肺。4、检测指标病毒TCID5tl体重变化、死亡率、肺部病理，并进行抗氧化能力评价。(I)感染和给药后各组小鼠体重和死亡率变化
如图4所示，感染和给药后，每天称量各组中小鼠的体重，结果显示，正常小鼠体重随时间的延长日渐上升，病毒感染组体重明显下降；结果表明，PEG修饰的人源过氧化氢酶对抑制体重下降及死亡率的作用具有量效关系。( 2 )肺指数和肺病变率
结果如表I所示，正常组小鼠肺部无病变，肺指数较小；病毒感染后各组肺指数均显著上升，平均肺重增至正常水平的3倍。肺部病理学评分，病毒感染后第5天，肺部平均淤血面积超过了总表面积的75%。结果表明，所述PEG修饰的人源过氧化氢酶能显著缓解肺部淤血水肿等病变，将病变区域面积减少至50%以下，显示出了剂量依赖性。表I
权利要求
1.PEG修饰的重组人源过氧化氢酶在制备治疗病毒、细菌引起的感染药物中的用途，所述的重组人源过氧化氢酶具有序列I的序列。
2.按权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的感染是病毒、细菌及烧伤感染引起的急性肺炎及烧伤感染。
3.按权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的病毒选自流感病毒、SARS病毒、呼吸道合胞病毒或冠状病毒。
4.按权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的细菌选自金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌或肺炎克雷博氏菌。
5.按权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶，为经PEG修饰、DNA序列为人源过氧化氢酶cDNA在毕赤酵母中表达并经纯化的产物。
6.按权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的药物制成鼻腔吸入剂、腹腔注射制剂或外用制剂。
7.按权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶通过下述方法制备 采用毕赤酵母表达的人源过氧化氢酶，将发酵液4°C离心，收集上清，用硫酸铵沉淀粗酶液后，依次上苯基纤维素疏水柱、Q-Sepharose FF和羟基磷灰石，获得95%纯度的目的蛋白，将纯化的人源过氧化氢酶和活化的PEG 5000以一定的摩尔比投入到硼酸缓冲液，4°C混合均勻后搅拌反应2h,将修饰反应混合物取适当的蛋白量上样于预先装好的SephacrylS-300树脂，用20mmol/L的pH 7.0的PBS洗脱，流速lml/min ;核酸蛋白检测仪于280nm处监测洗脱液蛋白含量，并用自动收集仪收集各流分，进行SDS-PAGE电泳分析；收集的PEG修饰的人源过氧化氢酶透析后分装入灭菌的安培瓶，冷冻干燥，-20°C保存备用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及PEG修饰的重组人源过氧化氢酶的药物用途。本发明中，所述的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶，为经PEG修饰、DNA序列为人源过氧化氢酶cDNA在毕赤酵母中表达并经纯化的产物；其可有效对抗流感病毒H1N1、FM1导致的急性肺炎，使肺部病毒滴度减少、抗氧化能力和动物免疫保护增强、减缓急性肺炎的病理进程，降低死亡率，延长存活时间。本发明所述的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶可制成鼻腔吸入剂、腹腔注射制剂或外用制剂，用于治疗病毒、细菌及烧伤等感染引起的急性肺炎及烧伤感染。
文档编号A61P17/02GK102772789SQ20111011988
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月10日 优先权日2011年5月10日
发明者冯美卿, 史训龙, 叶丽, 周伟, 周珮, 施志惠, 朱海燕, 李继杨, 黄海 申请人:复旦大学